Afin de s’affranchir des limites de résolution imposées par les lois de l’optique* et ainsi atteindre de plus hautes résolutions, différentes technologies de microscopie de fluorescence ont été récemment développées. Regroupées sous les termes de microscopie de « super-résolution » ou « nanoscopie », elles permettent de localiser, in vivo, au sein même des cellules, des composés à l’échelle de la molécule unique (résolutions latérales de l’ordre de 10 à 90 nm). Ces technologies qui font soit appel à des principes semblables au pointillisme (PALM/STORM) soit à de l’illumination structurée (SIM) ou à de la déplétion laser (STED) ont valu à leurs auteurs, E. Betzig, S. Hell et W. Moerner, l’attribution du prix Nobel de Chimie en 2014.
Mener une recherche compétitive dans de nombreux domaines de la biologie requiert dorénavant l’accès à la microscopie super-résolue, raison pour laquelle TRI développe un pôle de microscopie de super-résolution bénéficiant de ces différentes approches et ouvert à l’ensemble de la communauté scientifique.
Équipements Industriels
- Équipements de type dSTORM et STED au CPTP. Le premier développe des approches de type dSTORM monocouleur en microscopie TIRF, avec un laser 640 nm de 400 mW. Quand au second, le STED, son originalité réside dans le fait qu’il est le seul microscope de super-résolution permettant de travailler sur coupe de tissus en 3D, permettant ainsi d’accéder à la physiopathologie humaine avec une résolution très fine (30 nm).
- Un équipement similaire, le N-Storm est opérationnel au sein des plateformes réunies sous la bannière commune LICT (CBD / LBCMCP). Il utilise les mêmes technologies que les précédents mais permets des observations dans des longueurs d’ondes plus variées.
- Un équipement de type ELYRA PS1 de la société Zeiss a été implanté sur le site de l’I2MC. Ce microscope de super-résolution utilise un concept d’analyse des nano-interactions au niveau des contacts entre différents types cellulaires ou entre les cellules et la matrice extracellulaire. Grâce à cet équipement, il est possible d’analyser un même échantillon par les trois des technologies citées précédemment, SIM et STORM ou PALM, afin d’obtenir un résultat extrêmement fin, permettant de localiser avec précisions des molécules uniques.
Technologie de R&D
Deux microscopes en développement, basés sur une technique couplant l’Illumination structurée SIM et de localisation 3D, sont opérationnels au sein du site LITC. Intégrant les dernières innovations en imagerie par illumination structurée provenant des laboratoires de microscopie de renommée internationale (IPHT – Allemagne, Institut Fresnel – France, ISMO – France, Jenelia Lab – USA), ils permettent de s’affranchir des contraintes expérimentales rencontrées dans les équipements classiques de super-résolution. Un soutien technologique provenant des sociétés françaises Oxxius (technologie laser) et AbbeLight (localisation 3D supercritique) sera effectif sur l’année 2016.
A gauche : La Chaine laser R&D (Photo D.Villa). A droite a/ : Principe de l’imagerie structurée avec 9 grilles à fort contrastes à la limite de résolution optique pour l’imagerie SIM 2D. b/ : extension de la résolution grâce aux méthodes de déconvolutions assistées par des grilles. Bas : Exemple d’imagerie conventionnelle et super-résolue à 80nm de résolution d’adhésion focale (échelle 640nm).
Ces équipements pourront être couplés à des techniques existantes telles que de l’opto-manipulation :
- SIM conventionnel TIRF 2D et SIM 3D à une fréquence temporelle de 20 images / s. Cette technique autorisera ainsi l’imagerie super-résolue de phénomène rapide telle que la mitose et l’endocytose,
- SIM non-linéaire 2D rapide autorisant une résolution de 50nm à l’aide de molécules photo-activables en GFP (fréquence d’acquisition : 5 images / s). Elle sera dédiée à l’imagerie du cytosquellete et de la chromatine (accessible au printemps 2016),
- Imagerie 3D SIM isotrope mutilicouleurs à un seul objectif afin de démocratiser l’imagerie isotropique super-résolue en utilisant un statif de microscope conventionnel (accessible en fin d’année 2016),
- Imagerie SIM TIRF 2D associée à la localisation 3D par collection supercritique, en collaboration avec AbbeLight (implémentation en juillet 2016). Elle permettra d’atteindre une résolution voisine de 20nm en Z,
- Reconstruction 3D SIM via une nouvelle methode de déconvolution SIM adaptée au tissus vivants (BLIND SIM), pas disponible via les algorithmes commerciaux.
* « De la microscopie à la nanoscopie« , M.Moreau, P.Cochard, m/s n°12, vol.30, décembre 2014